2.
DOLOČANJE ACETILHOLINESTERAZE V HUMANIH KRVNIH VZORCIHTjaša Birsa, 2018, magistrsko delo
Opis: V strokovni literaturi zasledimo encim acetilholinesterazo (AChE) v različnih raziskavah s področja okoljevarstva, medicine in veterine. Zmanjšana encimska aktivnost je lahko indikator onesnaženosti okolja z organofosfatnimi in karbamatnimi pesticidi, policikličnimi aromatskimi ogljikovodiki ter težkimi kovinami. Spremembe v encimski aktivnosti AChE pa so tudi biološki označevalec nekaterih nevrodegenerativnih bolezni pri človeku.
V človeškem telesu se encim AChE primarno nahaja v živčnem sistemu, najdemo pa ga tudi v krvi, zlasti v membranah eritrocitov. V krvi je v večji meri prisoten tudi encim butirilholinesteraza (BChE), ki ravno tako spada v družino holinesteraz. Naš cilj je bil razviti metodo, ki bi omogočala specifično merjenje encimske aktivnosti AChE v okviru celotnih holinesteraz v krvnem serumu.
Za merjenje encimske aktivnosti smo uporabili Ellmanovo metodo. Količino obarvanih produktov reakcije smo določali s spektroskopijo s toplotnimi lečami TLS in z UV-VIS spektrofotometrijo. Z različnimi koncentracijami čistega encima AChE smo najprej določili mejo zaznavnosti obeh metod (LOD). Detekcija s TLS je bila bolj občutljiva, saj je bil LOD 3,13-krat manjši kot pri detekciji z UV-VIS. Potem smo izmerili encimsko aktivnost celotnih holinesteraz AChE in BChE v serumskih vzorcih zdravih ljudi. Izračunana encimska aktivnost holinesteraz se je v analiziranih vzorcih gibala med 3004 mU mL-1 in 5698 mU mL-1. Po dodatku specifičnega inhibitorja BChE se je celotna encimska aktivnost znižala za najmanj 60 %, kar kaže, da večina holinesteraz v krvnem serumu pripada BChE. Preizkusili smo tudi metodo enojne imunske precipitacije, vendar se je le-ta izkazala za neuspešno pri ločevanju posameznih holinesteraz iz serumskih vzorcev.
Na podlagi naših rezultatov smo prišli do zaključka, da je za merjenje encimske aktivnosti posameznih holinesteraz AChE in BChE v krvnem serumu najprimernejša uporaba specifičnih inhibitorjev, vendar bi bilo to metodo potrebno še dodatno optimizirati.
Ključne besede: acetilholinesteraza, krvni serum, nevrodegenerativne bolezni, spektroskopija s toplotnimi lečami, UV-VIS spektrofotometrija, imunska precipitacija.
Objavljeno v RUNG: 07.11.2018; Ogledov: 7406; Prenosov: 183
Celotno besedilo (1,65 MB)