1. Določevanje aktivnosti AChE encima v človeškem serumu z uporabo FIA-TLS metode : Magistrsko deloAndrej Jerkič, 2018, magistrsko delo Opis: Acetilholinesteraza (AChE) in butirilholinesteraza (BChE) sta encima, odgovorna za razgradnjo nevrotransmitorja acetilholina oziroma butirilholina. Encima spadata v skupino holinesteraz in imata poleg razgradnje nevrotransmiterjev pomembno vlogo v telesu kot indikatorja za različne bolezni ter zastrupitve z organofosfati in drugimi kemikalijami.
Cilji magistrskega dela so razviti občutljivo metodo za določevanje aktivnosti AChE encima v človeškem serumu, določiti celokupno aktivnost AChE ter BChE encimov v vzorcih človeškega seruma neznanih pacientov z uporabo FIA-TLS tehnike ter izmeriti aktivnost AChE v človeškem serumu z uporabo inhibitorja BChE. Opravili smo meritve kinetike pretvorbe acetiltioholina v 5-tio-2-nitrobenzoat (TNB), na podlagi katerih smo izračunali specifično aktivnost AChE encima in aktivnosti različnih njegovih redčitev ter izvedli spektralno karakterizacijo proučevanih vzorcev. Vzorce AChE encima smo pripravili v raztopini 5,5'DITIO-bis (2-nitrobenzoični) kislini (reagent) in raztopini acetiltioholin jodida (substrat). Ugotovili smo, da je absorpcijski vrh za raztopine AChE pri valovni dolžini približno 412 nm. Z meritvami absorpcijskega spektra različnih redčitev AChE smo ugotovili, da absorbanca hitreje narašča v vzorcih z višjo koncentracijo AChE, ker se je povečevala aktivnost encima. Ugotovili smo tudi, da z nižanjem molarnosti DTNB iz 0,50 mM na 0,05 mM lahko znižamo LOD metode zaradi znižanja vrednosti signala slepega vzorca. Tega ne moremo trditi pri znižanju koncentracije DTNB iz 0,05 mM na 0,025 mM zaradi nepopolne reakcije med acetilholinom (ACh), 5-tio-2-nitrobenzoatom (TNB) in acetilholinesterazo (AChE). Metodo FIA-TLS smo optimizirali z uporabo daljše mešalne zanke ter s povečanjem moči vzbujevalnega žarka. Z optimizacijo FIA-TLS sistema nam je uspelo izmeriti vrednosti TLS signala vzorcev z nižjo koncentracijo AChE encima (70 μV) v primerjavi z neoptimiziranim TLS sistemom (110 μV). Izračunana vrednost LOD UV-Vis metode znaša 3,6 mU/ml, medtem ko za FIA-TLS metodo znaša 0,6 mU/ml. V prvem sklopu meritev smo izmerili 14 vzorcev krvnega seruma. Aktivnosti celotne ChE v teh vzorcih znašajo med 2118 mU/ml in 15172 mU/ml, povprečna aktivnost BChE in AChE v vzorcih znaša 4561 mU/ml, mediana meritev pa znaša 2964 mU/ml. V drugem sklopu meritev smo merili 19 vzorcev krvnega seruma z in brez dodatka BChE inhibitorja. Aktivnosti vzorcev brez BChE inhibitorja (celotne ChE) znašajo med 1642 mU/ml in 5958 mU/ml s povprečno vrednostjo 2910 mU/ml in mediano 2228 mU/ml, medtem ko aktivnosti istih vzorcev z dodanim inhibitorjem (samo AChE) znašajo od 519 mU/ml do 1118 mU/ml s povprečno vrednostjo 822 mU/ml in mediano 816 mU/ml. Po dodatku BChE se je aktivnost ChE v vzorcih v povprečju zmanjšala za 3,5-krat oziroma od 55 % do 85 %. Ključne besede: Acetilholinesteraza, butirilholinesteraza, FIA-TLS, aktivnost AChE encima, inhibicija BChE encima Objavljeno v RUNG: 30.11.2018; Ogledov: 5450; Prenosov: 182 Celotno besedilo (2,51 MB) |
2. DOLOČANJE ACETILHOLINESTERAZE V HUMANIH KRVNIH VZORCIHTjaša Birsa, 2018, magistrsko delo Opis: V strokovni literaturi zasledimo encim acetilholinesterazo (AChE) v različnih raziskavah s področja okoljevarstva, medicine in veterine. Zmanjšana encimska aktivnost je lahko indikator onesnaženosti okolja z organofosfatnimi in karbamatnimi pesticidi, policikličnimi aromatskimi ogljikovodiki ter težkimi kovinami. Spremembe v encimski aktivnosti AChE pa so tudi biološki označevalec nekaterih nevrodegenerativnih bolezni pri človeku.
V človeškem telesu se encim AChE primarno nahaja v živčnem sistemu, najdemo pa ga tudi v krvi, zlasti v membranah eritrocitov. V krvi je v večji meri prisoten tudi encim butirilholinesteraza (BChE), ki ravno tako spada v družino holinesteraz. Naš cilj je bil razviti metodo, ki bi omogočala specifično merjenje encimske aktivnosti AChE v okviru celotnih holinesteraz v krvnem serumu.
Za merjenje encimske aktivnosti smo uporabili Ellmanovo metodo. Količino obarvanih produktov reakcije smo določali s spektroskopijo s toplotnimi lečami TLS in z UV-VIS spektrofotometrijo. Z različnimi koncentracijami čistega encima AChE smo najprej določili mejo zaznavnosti obeh metod (LOD). Detekcija s TLS je bila bolj občutljiva, saj je bil LOD 3,13-krat manjši kot pri detekciji z UV-VIS. Potem smo izmerili encimsko aktivnost celotnih holinesteraz AChE in BChE v serumskih vzorcih zdravih ljudi. Izračunana encimska aktivnost holinesteraz se je v analiziranih vzorcih gibala med 3004 mU mL-1 in 5698 mU mL-1. Po dodatku specifičnega inhibitorja BChE se je celotna encimska aktivnost znižala za najmanj 60 %, kar kaže, da večina holinesteraz v krvnem serumu pripada BChE. Preizkusili smo tudi metodo enojne imunske precipitacije, vendar se je le-ta izkazala za neuspešno pri ločevanju posameznih holinesteraz iz serumskih vzorcev.
Na podlagi naših rezultatov smo prišli do zaključka, da je za merjenje encimske aktivnosti posameznih holinesteraz AChE in BChE v krvnem serumu najprimernejša uporaba specifičnih inhibitorjev, vendar bi bilo to metodo potrebno še dodatno optimizirati. Ključne besede: acetilholinesteraza, krvni serum, nevrodegenerativne bolezni, spektroskopija s toplotnimi lečami, UV-VIS spektrofotometrija, imunska precipitacija. Objavljeno v RUNG: 07.11.2018; Ogledov: 7138; Prenosov: 183 Celotno besedilo (1,65 MB) |
3. Applications of Thermal Lens Microscopy in Microfluidic SystemsMladen Franko, 2016, objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci (vabljeno predavanje) Opis: Detection in microfluidic systems requires highly sensitive analytical methods, because of the very short optical interaction length, which is usually in the range of 100 μm or shorter. Furthermore, the amounts of analytes in detection volumes are extremely small (femto- or attomoles). Thermal lens spectrometry and particularly thermal lens microscopy (TLM) appear as techniques of choice for detection in microfluidic and lab-on-a-chip systems, since they enable measurements of absorbance’s or absorbance changes as low as 10-7. In addition to ultra-high sensitivity, TLM offers high spatial resolution (≈1 μm) and sufficient temporal resolution (ms range), which is required for studies of processes in microfluidic systems.
Recent development of TLM theory and instrumentation lead to experimental confirmations of the effects of microfluidic flows on the TLM signal, which affects the sensitivity. On the other hand, these observations have enabled optimization of TLM instruments [1]. As a result of these advancements, applications of TLM were extended from simple laminar flows [2], to highly complex systems such as Tylor-type flows, where TLM detection provided data for description of diffusion processes in n-octane/methanol binary liquid systems [3]. The major streamline of TLM applications was however focused on the development of vanguard analytical systems [4], which are needed in various fields of chemical analysis, including food safety and quality control, environmental monitoring as well as biomedical research and diagnostics. Such systems are used as sample screening systems (sample filters or selectors) when the information is needed quickly to make immediate decisions in relation to the analytical problem. They provide simplicity (e.g. little or no sample pre-treatment), low cost, rapid and reliable response, and frequently give just binary responses. However, their major weakness is low metrological quality of results. Therefore, uncertainties of up to 5–15% are usually accepted as a toll for rapidity and simplicity, which are essential even though in contradiction with conventional analytical concepts. With the objective of developing new vanguard analytical systems, a relevant goal is to exploit the advantages offered by microfluidic lab-on-a-chip systems on one hand, and TLM detection on the other. In such combinations, the FIA approach simplifies sample handling (e.g. volume measurements) and transport to the detector, while microfluidic lab-on-a-chip technology can facilitate and speed up processes including colorimetric reactions, antigen–antibody or enzyme–substrate interactions in bioanalytical systems, and even extraction and preconcentration steps by introducing continuous flow processing and micro unit operations in chemical analysis [2]. High sensitivity of TLM in such systems offers low limits of detection, which also contribute to low uncertainties that are typically below 10%. An important advantage of microfluidic systems lies in the fact that small dimensions of such systems, which consist of capillaries and micro reactors with dimensions about 10 to 100 μm, significantly reduce the molecular diffusion time, which is inversely proportional to the second power of distance. For example, the time required for completion of an ELISA immunoassay for NGAL a biomarker of acute kidney failure was reduced from four hours to only 30 mins. [5, 6] when transferring the assay into a microfluidic system, while maintaining or even improving the sensitivity. Even more evident improvement in sample throughput (reduction of analysis time from 10 hours to 30 minutes) was achieved for determination of antibodies for human papilloma virus (anti L1 HPV 16) in blood plasma, after immobilizing adequate pseudovirions as antigens on magnetic nanobeads [6]. Other health-related applications include detection of toxins, such as microcystin, or carcinogenic substances such as Cr(VI), which offers improved limits of detection as compared to spectrophotometry as well as sample throughput, which can reach 20 samples/min. [7].
[1] M. Liu and M. Franko, Crit. Rev. Anal. Chem. 44, 328-353 (2014).
[2] T. Kitamori, M. Tokeshi, A. Hibara, and K. Sato, Anal. Chem. 76, 52A-60A (2004).
[3] M. Lubej, U. Novak, M. Liu, M. Martelanc, M. Franko and I. Plazl, Lab Chip (2015) DOI:10.1039/c4lc01460j.
[4] M. Valcárcel and B. Lendl. Trends Anal. Chem. 23, 527-534 (2004).
[5] T. Radovanović, M. Liu, P. Likar, M. Klemenc and M. Franko, Int. J. Thermophys. (2014) DOI:10.1007/s10765-014-1699-9.
[6] T. Radovanović, Dissertation, University of Nova Gorica (2016).
[7] M. Franko, M. Liu, A. Boškin, A. Delneri, and M.A. Proskurnin, Anal. Sci. 32, 23-30 (2016). Ključne besede: Spektrometrija TLM, mikrofluidni sistemi, biomarkerji, alergeni, pesticidi, acetilholinesteraza Objavljeno v RUNG: 07.11.2016; Ogledov: 6283; Prenosov: 44 Celotno besedilo (42,25 MB) |
4. Vrednotenje naravne aktivnosti acetilholinesteraze in koncentracije metalotioneinov v klapavicah (Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819)Jan Debenjak, 2015, diplomsko delo Opis: Škodljive učinke onesnaženja lahko določimo z merjenjem specifičnih odzivov na onesnaženje – z biomarkerji. Izmeril sem aktivnost acetilholinesteraze (odgovor na onesnaženje z organofosfatnimi in karbamatnimi pesticidi) in koncentracije metalotioneinov (odgovor na onesnaženje s težkimi kovinami) v klapavicah, ki so bile nabrane na štirih vzorčnih mestih. Izračunal sem kondicijski in gonadosomatski indeks klapavic ter izmeril okoljske parametre morske vode (temperatura, koncentracija kisika, slanost in pH). Meritve sem opravljal v pomladnem in v jesenskem obdobju leta 2011, da bi ugotovil, ali se vrednosti izmerjenih biomarkerjev razlikujejo med sezonami in med vzorčnimi mesti. Izbrana vzorčna mesta so bila: školjčišče ob Debelem rtiču (vzorčno mesto 00DB), marina v Kopru (vzorčno mesto 00TM) ter školjčišči v Strunjanskem (vzorčno mesto 0024) in Piranskem zalivu (vzorčno mesto 0035). Največjo aktivnost acetilholinesteraze (AChE) sem izmeril v klapavicah iz Strunjanskega zaliva (119 ± 18 μmol min-1 mg-1 v pomladnem vzorčenju in 114 ± 6 μmol min-1 mg-1 v jesenskem vzorčenju) in v klapavicah iz školjčišča ob Debelem rtiču (118 ± 11 μmol min-1 mg-1 v pomladnem vzorčenju in 109 ± 11 μmol min-1 mg-1 v jesenskem vzorčenju). Najnižjo aktivnost AChE sem izmeril v klapavicah z vzorčnega mesta 00TM v Koprskem zalivu: 75 ± 6 μmol min-1 mg-1 v pomladnem vzorčenju in 60 ± 7 μmol min-1 mg-1 v jesenskem vzorčenju. Izmerjena aktivnost AChE v klapavicah z vzorčnega mesta 0035 v Piranskem zalivu je bila 97 ± 12 μmol min-1 mg-1 v pomladnem vzorčenju ter 86 ± 8 μmol min-1 mg-1 v jesenskem vzorčenju. Najvišje koncentracije metalotioneinov (MT) so bile izmerjene v jesenskem vzorčenju, v klapavicah iz vzorčnega mesta 0035 v Piranskem zalivu, in sicer 79 ± 9 µg MT g-1 mokre mase vzorca. Najnižjo vsebnost MT v klapavicah sem izmeril jeseni, v vzorcih iz Koprskega zaliva (vzorčno mesto 00TM): 50 ± 6 µg MT g-1 mokre mase. V jesenskem času so bile koncentracije MT v vzorcih iz Strunjanskega zaliva (vzorčno mesto 0024) 75 ± 7µg MT g-1 mokre mase ter v vzorcih iz školjčišča ob Debelem rtiču (vzorčno mesto 00DB) 67 ± 15 µg MT g-1 mokre mase. Spomladi so bile koncentracije MT med vzorčnimi mesti bolj izenačene: na vzorčnem mestu 00TM je bila koncentracija MT 60 ± 3 µg MT g-1 mokre mase, enako na vzorčnem mestu 0035 v Piranskem zalivu (60 ± 10 µg MT g-1 mokre mase tkiva) ter 65 ± 9 µg MT g-1 mokre mase v vzorcih na vzorčnem mestu 00DB ob Debelem rtiču in 68 ± 10 µg MT g-1 mokre mase v vzorcih na vzorčnem mestu 0024 v Strunjanskem zalivu. Značilno nižjo koncentracijo MT sem izmeril na vzorčnem mestu 00TM v Koprskem zalivu v jesenskem vzorčenju. Razlik v koncentraciji MT med sezonama nisem ugotovil. Sezonskih razlik v aktivnosti AChE med vzorčnimi mesti nisem našel. Ugotovil sem, da je aktivnost AChE v klapavicah z vzorčnega mesta 00TM v Koprskem zalivu in v klapavicah iz Piranskega zaliva (vzorčno mesto 0035), v obeh sezonah značilno nižja, kar kaže na trajno izpostavljenost višjim koncentracijam onesnaževal, ki zavirajo AChE v primerjavi s preostalimi vzorčnimi mesti. Ključne besede: Mytilus galloprovincialis, acetilholinesteraza, metalotioneini, težke kovine, organofosfatni pesticidi Objavljeno v RUNG: 01.09.2015; Ogledov: 8102; Prenosov: 327 Celotno besedilo (3,30 MB) |
5. Poletna aktivnost acetilholinesteraze, glutation-S-transferaze in katalaze v klapavicah (Mytilus galloprovincialis) iz slovenskega morja : diplomsko deloTjaša Birsa, 2014, diplomsko delo Ključne besede: klapavice, acetilholinesteraza, glutation-S-transferaza, katalaza, biomonitoring, Jadransko morje, diplomske naloge Objavljeno v RUNG: 19.02.2015; Ogledov: 6046; Prenosov: 401 Celotno besedilo (814,32 KB) Gradivo ima več datotek! Več... |
6. |
7. |