| Opis: | Bioaktivne spojine so esencialne in neesencialne spojine, ki so del prehranske verige in vplivajo na delovanje organizmov, ali pa v njih povzročijo določene reakcije, vplivajo pa tudi na zdravje ljudi. Med različnimi bioaktivnimi spojinami, kot so tudi encimi in vitamini, so farmacevtske učinkovine ene najbolj poznanih. Najbolj široko uporabljena so različna protivnetna zdravila, antibiotiki, β-blokatori proti povišanemu krvnemu pritisku in statini proti holesterolu, od ostalih bioaktivnih snovi, povezanih z medicino, pa tudi kontrastna sredstva, ki jih uporabljamo za slikanje organov ter krvnih žil in pogosto povzročajo številne neželene učinke, kot je na primer pokontrastna nefropatija (angl. contrast induced nephropathy). Samo porabo antibiotikov ocenjujejo v svetovnem merilu na 200.000 ton letno.
V preteklosti in tudi danes v postopku proizvodnje, ali še pogosteje po uporabi, farmacevtske učinkovine spuščamo v vodno okolje preko industrijskih izpustov, komunalnih odplak in bolnišničnih odpadnih vod. Nekatere farmacevtske učinkovine so zelo obstojne in jih zato v bioloških čistilnih napravah lahko samo delno odstranimo iz odpadne vode. Zato jih najdemo tudi v površinskih vodah in podtalnici ter posledično v pitni vodi. V okolju so prisotne v majhnih koncentracijah, vplivi dolgotrajne izpostavljenosti organizmov različnim farmacevtskim izdelkom ali njihovim mešanicam pa še niso dovolj raziskani.
Komunalne in bolnišnične odpadne vode so tudi vir infektivnih organizmov, kot so npr. virusi, ki lahko prehajajo v vodno okolje tudi zaradi neprimernega ravnanja z infektivnimi odpadki. Biološke čistilne naprave iz vode odstranijo v povprečju le 50 % virusov, zato je voda kot »vir življenja«, lahko ključna za razširjanje nekaterih infektivnih organizmov, in z njimi povezanih bolezni, to pa zahteva stalen nadzor mikrobiološke kakovosti vode.
Ker so koncentracije bioaktivnih snovi in infektivnih organizmov v telesu in okolju običajno zelo nizke, potrebujemo za njihovo določevanje visoko občutljive metode, predvsem kromatografske analizne tehnike sklopljene z masno spektrometrijo (GC/MS, LC/MS in LC–MS/MS) in transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM). Te metode so visoko občutljive, zahtevajo pa veliko časa in uporabo dragih aparatur in velikih količin reagentov in organskih topil, ki so škodljivi za okolje. Zaradi vse večje potrebe po analizah velikega števila okoljskih vzorcev, je nujen razvoj novih, tako imenovanih naprednih metod, ki omogočajo hitro in zanesljivo pregledovanje velikega števila vzorcev v čimkrajšem času. Analize s takimi "presejalnimi" metodami so praviloma manj natančne ali celo semikvantitativne, a kljub temu omogočajo zanesljivo identifikacijo neproblematičnih vzorcev in v praksi omejijo potrebo po uporabi zahtevnih klasičnih analiznih metod le na nekaj odstotkov vseh vzorcev.
Zato je bil splošen cilj disertacije razvoj novih metod za občutljivo, hitro in cenovno učinkovito detekcijo farmacevtskih učinkovin, virusov in virusnih delcev v vodah in bioloških tekočinah in za ugotavljanje njihovih učinkov na organizme.
Nove metode smo zasnovali na kombinaciji spektrometrije TLS (spektrometrija s toplotnimi lečami), mikrofluidike in imunoloških metod kot je ELISA. TLS kot visoko občutljiva tehnika (omogoča meritev absorbanc pod 10-6) lahko v kombinaciji z mikrofluidnimi tehnologijami zagotovi detekcijo zelo nizkih koncentracij analitov, krajši čas analize in manjšo porabo reagentov. V takih kombinacijah mikrofluidna tehnologija olajša in pospeši interakcije antigen-protitelesa ali encim-substrat v bioanaliznih sistemih, kar izhaja iz majhnih dimenzij kapilar in mikroreaktorjev (premer 10 do 100 µm), ki znatno skrajšajo difuzijski čas velikih biomolekul. Obenem pa mikrofluidni sistemi zaradi 100 do 1000-krat krajših optičnih poti v primerjavi s konvencionalnimi spektrometrijskimi tehnikami, zahtevajo zelo občutljivo detekcijo, ki jo v primeru nefluorescenčnih analitov lahko zagotavlja le TLS. Tako je bil npr. s kombinacijo mikrofluidne ELISA tehnike in mikroskopske TLS detekcije (TLM) za določevanje B-natriuretičnega peptida (ang. brain natriuretic peptide) skrajšan čas analize z 20 ur na 20 minut, kot je opisano v literaturi. Pomembno je tudi, da je odziv TLS signala hiter (milisekunde), kar je zaradi relativno visokih linearnih hitrosti pretokov v mikrofluidnih sistemih nujen pogoj za učinkovito detekcijo v submikroliterskih vzorcih s koncentracijami v območju pg/mL.
Za dosego konkretnih ciljev doktorske disertacije smo razvili nove analizne metode za naslednje izbrane analite:
- jodirana kontrastna sredstva,
- NGAL- na nevtrofilno gelatinazo vezani lipokalin, kot novi biomarker pokontrastne nefropatije, oblike akutne poškodbe ledvic,
- protitelesa proti humanim papiloma virusom (HPV) in HPV-16 pseudovirionom.
Pri razvoju metod za detekcijo jodiranih kontrastnih sredstev smo raziskali tudi kemijsko razgradnjo jodiranih kontrastnih sredstev ter tako istočasno razvili metodo za njihovo morebitno odstranjevanje iz odpadnih vod.
Pri uvodnih raziskavah za razvoj metode za določevanje NGAL kot osnovo uporabili komercialno dostopne ELISA teste. Končni produkt reakcije substrata s hrenovo peroksidazo (HRP) v ELISA testu smo injicirali v mikrofluidni sistem, ki je služil le za transport vzorca do TLM detektorja na mikročipu. Tako smo ob primerljivi hitrosti analize dosegli mejo detekcije 1.4 pg/mL kar je 7 krat nižje v primerjavi s komercialnim ELISA testom (10 pg/mL). V nadaljevanju smo za razvoj metode za določevanje NGAL z µFIA-TLM namesto komercialno dostopnih mikrotitrskih ploščic uporabili magnetne nanodelce kot trdne nosilce za primarna protitelesa ELISA testa. Protitelesa smo tako lahko z magnetnim poljem zadrževali v mikrofluidnem sistemu in v njem izvedli vezavo NGAL in sekundarnih protiteles, kot tudi reakcijo substrata s HRP. Metoda za določevanje NGAL je glede na meje detekcije (LOD je 2.3 pg/mL) občutljivejša v primerjavi s komercialnimi ELISA testi v standardnih mikrotitrskih ploščicah (LOD je 10 pg/mL) in bistveno skrajša čas analize. TLM v kombinaciji z mikročipom namreč omogoča krajši čas posameznega koraka inkubacije (z ene ure na le 5 min) v postopku pred samo detekcijo NGAL in s tem skrajša čas trajanja analize s štirih ur v primeru komercialnega ELISA testa na 35 minut ter tako omogoča analizo večjega števila vzorcev. Opravili smo tudi analizo realnih vzorcev krvi, ki je pokazala, da so vrednosti NGAL izmerjene z µFIA-TLM ob uporabi magnetnih nanodelcev primerljive z vrednostmi izmerjenim s komercialnim ELISA testom. Kratek čas analize ob nadaljnji optimizaciji odpirajo nove možnosti za uporabo testa v medicinski diagnostiki in kliničnih raziskavah. Razvita metoda za določevanje NGAL je ob uporabi ustreznih protiteles lahko primerna tudi za detekcijo drugih farmacevtskih učinkovin ali različnih onesnaževal v okolju.
V okviru disertacije smo razvili tudi metodo za določevanje anti-HPV-16 L1 protiteles v serumu žensk, okuženih s HPV-16 virusom. Pri tem smo za zagotavljanje selektivnosti uporabili HPV/16 pseudovirione kot modelni sistem virusov za razvoj ELISA testa na mikrofluidnem čipu. Imobilizirani HPV-16 pseudovirioni služijo kot antigen na katerega se vežejo anti-HPV-16 L1 protitelesa, ki smo jih zaznavali s sekundarnimi, s HRP označenimi protitelesi in TLM detekcijo produkta encimske reakcije substrata in HRP. Ob izvedbi klasičnega ELISA testa na mikrotitrski plošči in merjenju na čitalcu mikrotitrskih plošč smo dosegli spodnjo mejo detekcije 3.8 ng/mL. Ob izvedbi meritve končne raztopine v mikrofluidnem čipu s TLM smo spodnjo mejo detekcije znižali na 0.9 ng/mL. Podobno kot pri metodi za določevanje NGAL smo v nadaljevanju raziskav uporabljali magnetne nanodelce kot trdne nosilce za pseudovirione in vse korake ELISA postopka izvedli v mikrofluidnem čipu kjer smo končni produkt reakcije substrata s HRP tudi detektirali s TLM. Tako smo za določevanje protiteles proti pseudovirionom HPV-16 virusom dosegli spodnjo mejo detekcije 0.6 ng/mL, kar je šestkrat nižje v primerjavi s klasičnim ELISA testom. Obenem smo trajanje analize skrajšali z 10 ur na 30 minut. Metodo smo uspešno validirali tudi z analizami realnih vzorcev serumov žensk pri katerih je bila predhodno potrjena okužba s HPV-16 virusom.
Za detekcijo kontrastnih sredstev smo razvili metodo, ki preko meritve koncentracije sproščenega jodida omogoča posredno semikvantitativno določitev koncentracije jodiranih kontrastnih sredstev. Za sproščanje jodida iz matične molekule kontrastnega sredstva iomeprola smo uporabili kemično reakcijo z bakrovimi ioni Cu2+ v prisotnosti H2O2. Po predhodni oksidaciji sproščenega jodida smo jod ekstrahirali v kloroform. Reakcija razgradnje kontrastnih sredstev je pokazala približno 70 % učinkovitost za odstranjevanje joda z izhodne spojine, če upoštevamo 60 % skupni izmerjeni izkoristek oksidacije jodida in ekstrakcije joda s kloroformom. Kloroform kot organsko topilo je zelo primeren za TLM meritve zaradi visokega ojačitvenega faktorja, ki je povezan z nizko toplotno prevodnostjo in visokim temperaturnim koeficientom lomnega količnika kloroforma, in teoretično zagotavlja približno 40-krat višjo občutljivost kot pri TLM meritvah v vodi, ter za vsak milivat vzbujevalne moči štirikrat višjo občutljivost kot spektrofotometrija. Ekstrakt joda smo injicirali v mikrofluidni čip in določili koncentracijo joda z optotermično mikroskopsko tehniko TLM. Razvita metoda μFIA-TLM za posredno določevanje kontrastnih sredstev, ki temelji na detekciji joda, zagotavlja okrog 60-krat nižjo mejo detekcije v primerjavi s spektrofotometrijo. S kombiniranjem mikrofluidnih tehnologij in TLM smo uspeli izboljšati mejo detekcije ob manjši porabi reagenta in vzorca v primerjavi s spektrofotometrijo. Spodnja meja detekcije 18 ng/mL za iomeprol, ki smo jo dosegli z μFIA-TLM, je 16-krat nižja v primerjavi z LOD za detekcijo iomeprola s tehniko HPLC (294 ng/mL). V primerjavi z LOD za določevanje iomeprola preko detekcije jodida z ionsko kromatografijo (133 ng/mL), omogoča µFIA-TLM detekcijo okrog 7-krat nižjih koncentracij.
S HPLC in HPLC/MS meritvami vzorcev raztopine po končanem postopku razgradnje kontrastnih sredstev pa smo pokazali, da izhodna spojina ni več prisotna in da nastajajo produkti, z različnim številom odcepljenih jodovih atomov iz izhodne molekule. S tem smo pokazali, da je uporabljena kemična reakcija razgradnje kontrastnih sredstev, kot je iomeprol, učinkovita in da bi jo lahko uporabili za odstranjevanje kontrastnih sredstev iz odpadnih vod. Reakcijo razgradnje kontrastnih sredstev, ki traja okrog 120 min lahko še skrajšamo z nadaljnjo optimizacijo reakcijskih pogojev.
Nove analizne metode, razvite v tej disertaciji, zagotavljalo spodnje meje detekcije za izbrane spojine, ki so bistveno (tudi do 60-krat) nižje v primerjavi s klasičnimi analiznimi metodami s transmisijskim načinom merjenja. Istočasno nove metode omogočajo krajši čas analize in analizo večjega števila vzorcev za hitrejše izvajanje (fast screening) presejalnih testov. µFIA-TLM z uporabo magnetnih nanodelcev za določevanje NGAL in protiteles proti HPV virusom imajo v primerjavi s komercialnim ELISA testom na mikrotitrski ploščici številne prednosti, med katerimi so večja površina za vezavo protiteles, manjša poraba reagentov in tudi krajši čas analize. ELISA testi v mikročipih z uporabo mikrofluidnih črpalk omogočajo tudi lažje izvajanje korakov izpiranja in nanosa reagentov, ki so časovno zahtevni in pogosto prinašajo velike napake, če jih izvajamo z ročnim pipetiranjem.
Čeprav tehnika TLS še ni dosegla primerne stopnje razvoja in uporabnosti za rutinske kemijske analize, lahko izboljšano metodo za detekcijo NGAL ali virusnih protiteles, ki smo jo razvili v okviru te disertacije, uporabimo za klinične študije in razvoj komercialnih testov za detekcijo virusov ali drugih bioaktivnih spojin za uporabo v bolnišnični diagnostiki.
|
|---|
