| Opis: | DNA vezavni transaktivacijski protein TDP-43 spada med heterogene jedrne ribonukleoproteinske delce (ang. hnRNPs).Izkazalo se je,da je TDP-43 glavna komponenta inkluzijskih telesc,ki jih običajno najdemo pri pacientih z amiotrofno lateralno sklerozo in frontotemporalno lobarno degeneracijo.Kot hnRNP ima TDP-43 različne vloge pri metabolizmu,lokalizaciji in transportu mRNA.Strukturno je sestavljen iz dobro ohranjene N-terminalne domene,dveh RNA-prepozavnih motivov ki sta potrebna za prepoznavanje in vezavo na UG bogata zaporedja RNK,in iz C-terminalne domene,bogate z glicinom.C-terminalna domena vsebuje tudi poliglutaminske ponovitve in Q/N bogato regijo,ki igrajo pomembno vlogo pri agregaciji samega TDP-43,interakcijah z drugimi hnRNP proteini in poliglutaminskimi ponovitvami.Pričujoče delo se osredotoča na strukturne determinante,ki sodelujejo pri interakcijah TDP-43 s samim seboj in z drugimi hnRNP proteini.V te interakcije sta vključeni tako C- kot tudi N-terminalna domena.V sklopu te raziskave smo mapirali regije,ki so relevantne za normalno elovanje TDP-43 kot tudi pri agregacijskih procesih značilnih za patološko kaskado,ki vodi v nevrodegeneracijo.V prvem delu smo se osredotočili na N-terminalno domeno.Predhodni rezultati,ki smo jih v našem laboratoriju pridobili s pomočjo modela celične agregacije,kažejo na to,da tudi N-terminalna domena sodeluje pri sekvestraciji endogenega TDP-43 v agregate. Da se monomeri TDP-43 lahko povežejo in agregirajo,je potrebno celotno zaporedje N-terminalne domene,natančneje aminokislinska ostanka 1 in 77.Z namenom da bi podrobneje preiskali vlogo N-terminalne domene v povezavi s strukturo proteina kot tudi z njegovo funkcijo,smo pripravili serijo proteinov z modifikacijami v glavnih strukturnih motivih (α-heliksih in β-ploskvah),katerih funkcijo in strukturo smo analizirali s pomočjo tehnike NMR.Odkrili smo, da z zrušenjem sekundarne strukture N-terminalne domene (mutacija v α-heliksu NTD-31V/R-32T/R),TDP-43 agregati sekvestrirajo manj endogenega TDP-43 kot sicer ter da prisotnost mutiranega proteina ne povzroči zadostne agregacije endogenega TDP-43,da bi to motilo njegovo normalno delovanje v celici.Poleg tega z ekspresijo mutiranega TDP-43 ne uspemo nadomestiti funkcije endogenega TDP-43,ko je normalno delovanje le-tega onemogočeno zaradi sekvestracije v citoplazmi.Manjša stabilnost proteina,do katere privede zamenjava aminokislinskih ostankov v α-heliksu,vpliva na sposobnost proteina za tvorbo aktivne konformacije.Da bi razumeli,kateri segmenti TDP-43 so sposobni vezave v agregate,smo sintetizirali hibridne peptide,ki vsebujejo določene segmente N- in C-terminalnih regij.Rezultati so pokazali,da imajo ti peptidi večjo tendenco,da spodbudijo agregacijo TDP-43,in ne toliko da bi se sami vezali v agregate.To je najverjetneje posledica specifičnih funkcionalnih karakteristik segmentov N- in C- terminalnih domen,ki smo jih uporabili pri sintezi.Glavni fokus te naloge so bila zaporedja C-terminalne domene,ki so vključena v interakcije med proteini,nepravilno zvijanje in njegovo agregacijo.Primerjava aminokislinskega zaporedja pri človeku,miši,navadni cebrici,ploskem črvu in vinski mušici je pokazala visoko ohranjenost N-terminalne domene,hkrati pa velike razlike v zaporedju C-terminalnega konca.Študija se osredotoča na človeške ortologe in ortologe vinske mušice,saj ortolog vinske mušice vključuje tri izoforme proteina TDP-43.Skozi serijo delecij in mutacij smo pokazali,da je krajša izoforma TDP-43 pri vinski mušici (TBPH-RA) aktivnejša kot daljša (TBPH-RC).Razlog za to tiči v kombinaciji dveh faktorjev;TBPH-RP je bolj dovzeten za agregacijo,poleg tega pa funkcionalnost TBPH-RC negativno regulirajo intramolekularne interakcije C-terminalne domene.Kot kaže,obstaja kationska-π interakcija med triptofanom in argininom v C-terminalni domeni TBPH-RC,ki je pomembna pri sami funkciji.Le-ta ni prisotna pri TBPH-RA izoformi.V sklopu naloge smo okarakterizirali strukturne lastnosti TDP-43... |
|---|
