| Abstract: | Kljub splošni ozaveščenosti ljudi glede okoljske problematike, onesnaženje v 21. stoletju še vedno ogroža zdravje ljudi in živali na globalni ravni. Splošne težave, povezane s kemičnimi snovmi v okolju, so slaba biološka razgradljivost ter njihovo kopičenje v okolju, kar lahko privede do zastrupitve organizmov, ki pridejo z določeno snovjo v neposreden stik. Škodljive snovi lahko pristanejo v prehranjevalni verigi. Te pa niso nujno umetne, kot so pesticidi in farmacevtske učinkovine, temveč tudi naravni toksini rastlinskega ali živalskega izvora. Tudi slabe higienske razmere so lahko še vedno zelo pogost razlog za bolezni, ki izvirajo iz hrane. Znane so zastrupitve z biogenimi amini, ki med postopki za pripravo živil s fermentacijo, pri aktivnem delovanju nekaterih vrst bakterij nastajajo kot stranski produkt iz aminokislin. Te snovi večinoma tvorijo Gram negativne bakterije, zato so biogeni amini tudi pokazatelji higienskih razmer med pridelovanjem in predelovanjem hrane.
Za določitev več organskih spojin hkrati v zelo kompleksni matrici, so se za najbolj primerne izkazale konvencionalne (rearguard) metode. Te metode se odlikujejo tako po robustnosti, kot tudi po selektivnosti in občutljivosti. Podrugi strani se na tem področju uveljavljajo tudi t. i. presejalne metode (screening ali vanguard methods), ki predstavljajo preprostejšo analizno metodo s hitrimi da/ne odgovori na analizna vprašanja. Omenjene metode so cenejše in vključujejo minimalno predhodno obdelavo vzorca, kot je čiščenje ali pred-koncentriranja. Kombinacija vanguard-rearguard strategije tako ponuja vmesno pot med klasično analitiko s poudarkom na občutljivosti, točnosti in natančnosti ter produktivnostjo v smislu cenejše in hitrejše analize z manjšo, a še vedno zadovoljivo točnostjo in natančnostjo.
V prvem delu disertacije so predstavljene raziskave o izvedljivosti uporabe novih metod na osnovi TLS in/ali TLM pri določitvi atorvastatina (ATV) ter ohratoksina A (OTA). Po redčenju ATV derivata z organskim topilom se absorpcijski vrh premakne h krajšim valovnim dolžinam, ki niso več v dosegu našega detekcijskega sistema. Napovedane meje detekcije (LOD) pri določitvi ATV z uporabljenim TLM sistemom dosežejo tako le 0,3 mg/L, zaradi česar je detekcija ng/L-g/L koncentracij, ki so navadno prisotne v okolju, neizvedljiva. Pri ELISA testu za določanje ohratoksina A z mikrofluidno injekcijsko analizo v kombinaciji z detekcijo TLM (μFIA-TLM) pa se je pokazal velik vpliv visokega signala in šuma ozadja, ki se je odrazil v visokih mejah detekcije, ter slabša ponovljivost meritev. Ocenili smo, da mej detekcije nove metode za OTA ne bomo mogli bistveno znižati, zato se je nadaljevanje raziskav izkazalo za neupravičeno.
Konvencionalno metodo na osnovi tekočinske kromatografije visoke zmogljivosti in dvožarkovnrga spektrometera na osnovi toplotnih leč (HPLC-TLS) smo uporabili za detekcijo štirih najpogosteje prisotnih biogenih aminov (BA) v vinu, tj. putrescina, kadaverina, histamina in tiramina. Optimizacija metode je obsegala optimizacijo kromatografskega dela ter detekcijskega dela z optimizacijo TLS parametrov. Izvedena je bila tudi študija stabilnosti dabsil-BA derivatov pri izpostavljenosti laserski svetlobi. TLS detekcija je pokazala 3,6-krat nižje meje detekcije od DAD detekcije. Z metodo standardnega dodatka smo dosegli izkoristke v območju 86−117 %. Ustreznost metode smo preverili na vzorcih belega in rdečega vina. Rezultate smo primerjali s tistimi, pridobljenimi z uporabo fluorescenčne metode za detekcijo BA (OIV metoda). Metoda standardnega dodatka se je izkazala za uspešno pri odpravi učinka matrice vina in s HPLC-TLS izmerjene koncentracije so se dobro ujemale z rezultati OIV metode. Z uporabo dabsil klorida namesto fluorescenčnega orto-ftalaldehida (OPA) pri OIV metodi, pa se izognemo nestabilnosti fluorescenčnih derivatov.
Razvili smo tudi novo presejalno metodo za določevanje celokupne koncentracije biogenih aminov. Nova metoda sestoji iz mikrofluidnega dela, kombiniranega z mikroskopom s termičnimi lečami (μFIA-TLM). Za detekcijo smo BA najprej s pomočjo mikrobne transglutaminaze (MTG) encimsko deaminirali in nato sproščeni amonijak z Berthelotovo reakcijo pretvorili v modro obarvani indofenol. V začetnih raziskavah smo za optimizacijo meritev indofenola v šaržnem načinu, v μFIA-TLM sistemu nepovezanem z indofenolno reakcijo (off-line) in v μFIA-TLM sistemu, v katerem je potekala tudi indofenolna reakcija (on-line), uporabili raztopino amonijevega klorida (NH4Cl). Po dodatku 50 % etanola v šaržnem sistemu smo izboljšali meje detekcije za kar 9-krat. Preverili smo tudi stabilnost indofenola pod TLM pogoji ter optimizirali mikrofluidne pogoje ter TLM pogoje v dveh pretočnih μFIA-TLM sistemih. Ugotovili smo, da 5% dodatek etanola v nosilno tekočino, ki je hkrati tudi reagent pri on-line indofenolni reakciji, izboljša razmerje signal-šum za faktor tri. Z določitvijo optimalnega pufra (pH=7, 0,5 M) in alkalnih pogojev (2M NaOH) smo optimizirali tudi skupno reakcijo. Ugotovili smo tudi vpliv že prisotnih aminov v vzorcu na celotno reakcijo, ki se lahko odraža v pozitivnih napakah meritev ter predstavili tudi možne rešitve za zmanjšanje njihovega vpliva na določanje biogenih aminov. Z novo on-line μFIA-TLM metodo smo dosegli mejo detekcije 2,3 μM, ki je obenem tudi meja detekcije za amonij. S tem smo μFIA-TLM tehniko potrdili tudi kot dovolj občutljivo za določevanje amonija v odpadnih vodah, kjer so koncentracije le-tega v območju mg/L.
Podobne LOD vrednosti (3,2 μM) smo dosegli tudi za določitev celokupne koncentracije štirih BA. Ta vrednost predstavlja mejo detekcije za histamin 3,8 μM, kar je več kot štirikrat nižja vrednost od najnižje priporočene meje za ta toksični biogeni amin v vinu, ki znaša 2 mg/L ali 18 μM. Da bi izkoristili možnosti popolnoma avtomatiziranega sistema, smo encim imobilizirali na magnetne nanodelce. Uspešna imobilizacija encima tako odpira možnosti za vpeljavo encima v miniaturiziran biosenzor. |
|---|
