Search the repository

A+ | A- | | SLO | ENG

Abstract: Acetilholinesteraza (AChE) in butirilholinesteraza (BChE) sta encima, odgovorna za razgradnjo nevrotransmitorja acetilholina oziroma butirilholina. Encima spadata v skupino holinesteraz in imata poleg razgradnje nevrotransmiterjev pomembno vlogo v telesu kot indikatorja za različne bolezni ter zastrupitve z organofosfati in drugimi kemikalijami. Cilji magistrskega dela so razviti občutljivo metodo za določevanje aktivnosti AChE encima v človeškem serumu, določiti celokupno aktivnost AChE ter BChE encimov v vzorcih človeškega seruma neznanih pacientov z uporabo FIA-TLS tehnike ter izmeriti aktivnost AChE v človeškem serumu z uporabo inhibitorja BChE. Opravili smo meritve kinetike pretvorbe acetiltioholina v 5-tio-2-nitrobenzoat (TNB), na podlagi katerih smo izračunali specifično aktivnost AChE encima in aktivnosti različnih njegovih redčitev ter izvedli spektralno karakterizacijo proučevanih vzorcev. Vzorce AChE encima smo pripravili v raztopini 5,5'DITIO-bis (2-nitrobenzoični) kislini (reagent) in raztopini acetiltioholin jodida (substrat). Ugotovili smo, da je absorpcijski vrh za raztopine AChE pri valovni dolžini približno 412 nm. Z meritvami absorpcijskega spektra različnih redčitev AChE smo ugotovili, da absorbanca hitreje narašča v vzorcih z višjo koncentracijo AChE, ker se je povečevala aktivnost encima. Ugotovili smo tudi, da z nižanjem molarnosti DTNB iz 0,50 mM na 0,05 mM lahko znižamo LOD metode zaradi znižanja vrednosti signala slepega vzorca. Tega ne moremo trditi pri znižanju koncentracije DTNB iz 0,05 mM na 0,025 mM zaradi nepopolne reakcije med acetilholinom (ACh), 5-tio-2-nitrobenzoatom (TNB) in acetilholinesterazo (AChE). Metodo FIA-TLS smo optimizirali z uporabo daljše mešalne zanke ter s povečanjem moči vzbujevalnega žarka. Z optimizacijo FIA-TLS sistema nam je uspelo izmeriti vrednosti TLS signala vzorcev z nižjo koncentracijo AChE encima (70 μV) v primerjavi z neoptimiziranim TLS sistemom (110 μV). Izračunana vrednost LOD UV-Vis metode znaša 3,6 mU/ml, medtem ko za FIA-TLS metodo znaša 0,6 mU/ml. V prvem sklopu meritev smo izmerili 14 vzorcev krvnega seruma. Aktivnosti celotne ChE v teh vzorcih znašajo med 2118 mU/ml in 15172 mU/ml, povprečna aktivnost BChE in AChE v vzorcih znaša 4561 mU/ml, mediana meritev pa znaša 2964 mU/ml. V drugem sklopu meritev smo merili 19 vzorcev krvnega seruma z in brez dodatka BChE inhibitorja. Aktivnosti vzorcev brez BChE inhibitorja (celotne ChE) znašajo med 1642 mU/ml in 5958 mU/ml s povprečno vrednostjo 2910 mU/ml in mediano 2228 mU/ml, medtem ko aktivnosti istih vzorcev z dodanim inhibitorjem (samo AChE) znašajo od 519 mU/ml do 1118 mU/ml s povprečno vrednostjo 822 mU/ml in mediano 816 mU/ml. Po dodatku BChE se je aktivnost ChE v vzorcih v povprečju zmanjšala za 3,5-krat oziroma od 55 % do 85 %.
Keywords: Acetilholinesteraza, butirilholinesteraza, FIA-TLS, aktivnost AChE encima, inhibicija BChE encima
Published in RUNG: 30.11.2018; Views: 4944; Downloads: 176
Full text (2,51 MB)

Keywords: Beam deflection spectroscopy, diffusive gradients in thin-films, iron species, photothermal techniques, natural waters.
Published in RUNG: 09.11.2018; Views: 4031; Downloads: 0
This document has many files! More...

Abstract: V strokovni literaturi zasledimo encim acetilholinesterazo (AChE) v različnih raziskavah s področja okoljevarstva, medicine in veterine. Zmanjšana encimska aktivnost je lahko indikator onesnaženosti okolja z organofosfatnimi in karbamatnimi pesticidi, policikličnimi aromatskimi ogljikovodiki ter težkimi kovinami. Spremembe v encimski aktivnosti AChE pa so tudi biološki označevalec nekaterih nevrodegenerativnih bolezni pri človeku. V človeškem telesu se encim AChE primarno nahaja v živčnem sistemu, najdemo pa ga tudi v krvi, zlasti v membranah eritrocitov. V krvi je v večji meri prisoten tudi encim butirilholinesteraza (BChE), ki ravno tako spada v družino holinesteraz. Naš cilj je bil razviti metodo, ki bi omogočala specifično merjenje encimske aktivnosti AChE v okviru celotnih holinesteraz v krvnem serumu. Za merjenje encimske aktivnosti smo uporabili Ellmanovo metodo. Količino obarvanih produktov reakcije smo določali s spektroskopijo s toplotnimi lečami TLS in z UV-VIS spektrofotometrijo. Z različnimi koncentracijami čistega encima AChE smo najprej določili mejo zaznavnosti obeh metod (LOD). Detekcija s TLS je bila bolj občutljiva, saj je bil LOD 3,13-krat manjši kot pri detekciji z UV-VIS. Potem smo izmerili encimsko aktivnost celotnih holinesteraz AChE in BChE v serumskih vzorcih zdravih ljudi. Izračunana encimska aktivnost holinesteraz se je v analiziranih vzorcih gibala med 3004 mU mL-1 in 5698 mU mL-1. Po dodatku specifičnega inhibitorja BChE se je celotna encimska aktivnost znižala za najmanj 60 %, kar kaže, da večina holinesteraz v krvnem serumu pripada BChE. Preizkusili smo tudi metodo enojne imunske precipitacije, vendar se je le-ta izkazala za neuspešno pri ločevanju posameznih holinesteraz iz serumskih vzorcev. Na podlagi naših rezultatov smo prišli do zaključka, da je za merjenje encimske aktivnosti posameznih holinesteraz AChE in BChE v krvnem serumu najprimernejša uporaba specifičnih inhibitorjev, vendar bi bilo to metodo potrebno še dodatno optimizirati.
Keywords: acetilholinesteraza, krvni serum, nevrodegenerativne bolezni, spektroskopija s toplotnimi lečami, UV-VIS spektrofotometrija, imunska precipitacija.
Published in RUNG: 07.11.2018; Views: 6434; Downloads: 177
Full text (1,65 MB)

Keywords: HPLC-DAD and UV-VIS spectrometry, vinylphenolic pyranoanthocyanins formation in synthetic Pinot Noir grape, sequential fermentations with non-Saccharomyces yeast
Published in RUNG: 16.07.2018; Views: 4171; Downloads: 0
This document has many files! More...

Keywords: flow injection analysis, iron concentration, ocean water, thermal lens spectroscopy
Published in RUNG: 16.07.2018; Views: 4407; Downloads: 0
This document has many files! More...