Repository of University of Nova Gorica

Show document
A+ | A- | Help | SLO | ENG

Title:Novel methods for detection of bioactive substances and their effects in organisms and in the environment
Authors:ID Radovanović, Tatjana (Author)
ID Franko, Mladen (Mentor) More about this mentor... New window
Files:.pdf Disertacija_Tatjana_Radovanovic_Vukajlovic_20.01.2017_online_verzija.pdf (4,66 MB)
MD5: 4C515FE30EEFCC5C1A196B177FA0FA89
Work type:Doctoral dissertation
Typology:2.08 - Doctoral Dissertation
Organization:FPŠ - Graduate School
Abstract:Since the concentration of bioactive substances and infectious agents in organisms and in the environment are low highly sensitive techniques such as: chromatography technology coupled with mass spectrometry (GC/MS, LC/MS and LC–MS/MS) and transmission electron microscopy (TEM) are needed for their detection. These techniques are highly sensitive, but time consuming, requiring use of expensive apparatus and large quantities of reagents and organic solvents which are harmful for the environment. Because there is a growing need for analysis of a large number of environmental samples it is necessary to develop new, so called vanguard methods that enable rapid and reliable screening of large numbers of samples in the shortest possible time. Analysis with such “screening” methods are often less accurate or even semi-quantitative, but nevertheless allow reliable identification of nonproblematic samples and in practice they limit the use of demanding classical analytical methods to only a few percent of all the samples. Therefore, general objectives of the thesis were development of novel methods for sensitive, fast and cost effective detection of pharmaceuticals, viruses and viral particles in waters and biological fluids and for detection of their effects in organisms. Novel methods were based on the combination of TLS (Thermal Lens Spectrometry), microfluidics and immunological methods such as ELISA. TLS as highly sensitive technique (allowing detection of absorbances of less than 10-6) coupled with microfluidic technology allows detection of very low analyte concentration, shorter time for analysis, higher sample throughput and low consumption of reagents. In such combination microfluidic technology can simplify or speed up antigen-antibody or enzyme-substrate interactions in bioanalytical systems. Decisive advantage of microfluidic systems lies in the fact that small dimensions of such systems, composed of capillaries and micro-reactors with dimensions from about 10 to 100 µm, significantly reduce diffusion time, which is inversely proportional to second power of distance. However, highly sensitive detection techniques are needed in microfludic systems, because the amounts of analytes in detection volumes are generally small and optical interaction lengths are two to three orders of magnitude shorter than in conventional spectrometric techniques. By combining microscopic TLS (TLM) with microfluidic technique it is possible to reach very low limits of detection and at the same time shorten ELISA analysis time from 20 h to 20 minutes as was described before in the literature for detection of BNP (brain natriuretic peptide). TLM furthermore allows measurements of extremely small volumes (sub-microliter) as well as fast signal response (milliseconds). In this Dissertation specific goals were the development of new methods for detection of selected bioactive substances and infectious agents: -iodinated contrast agents -NGAL (neutrophil gelatinase associated lipocalin) as a new biomarker of contrast induced nephropathy (CIN) -antibodies against human papilloma viruses (HPV) viruses and HPV-16 pseudovirions. For the development of new method for detection of iodinated contrast agents chemical degradation of iodinated contrast agents was investigated as well, as a potential method for their removal from waste water. For the determination of NGAL, a commercially available ELISA kit was used as the basis for method development. In the initial experiments the final product of the reaction of substrate with enzyme HRP (horse radish peroxidase) was transferred from microtiter plate into a microfluidic system, which served just for the sample transport to TLM detector on microchip. With comparable speed analysis we achieved LOD of 1.4 pg/mL which is 7 times lower in comparison to commercial ELISA test (LOD=10 pg/mL). For further development of the method for detection of NGAL with µFIA-TLM magnetic nanobeads were used as a solid support for primary antibodies of ELISA assay. By applying appropriate magnetic field the antibodies were kept in microfluidic system, which also enabled binding of NGAL, secondary antibodies and reaction of substrate with HRP. Developed method for NGAL detection with LOD of 2.3 pg/mL compares favorably with LOD for commercial ELISA tests (10 pg/mL) in standard microtiter plates and significantly reduces the analysis time. TLM in combination with microchip for NGAL detection reduces the duration of individual incubation steps (from one hour to 5 minutes) and at the same time shortens total analysis time from four hours for commercial ELISA test to 35 minutes allowing higher sample throughput. Analysis of real blood samples was also performed and it has shown good agreement between NGAL concentrations measured by magnetic nanobeads based µFIA-TLM with the concentrations measured by a commercial ELISA test. Such short analysis time of analysis and possible further optimizations are opening new possibilities for application of µFIA-TLM in medical diagnostics and clinical research. By using appropriate antibodies the method for developed NGAL detection could be easily adopted for detection of different pharmaceuticals or pollutants in environmental samples. We have also developed a magnetic nanobeads based ELISA assay for detection of anti-HPV-16 L1 antibodies in the sera of HPV-16 infected women. To ensure the selectivity, HPV-16 pseudovirions were used as an antigen for anti-HPV-16 L1 antibodies, which were detected with secondary HRP labeled antibodies. Initially the ELISA assay for antibodies against HPV pseudovirions was performed on a microtiter plate and an LOD of 3.8 ng/mL was achieved by measurement on a microtiter plate reader. When performing a µFIA-TLM measurement of the final ELISA solution the LOD was reduced to 0.9 ng/mL. Similar to the method for NGAL detection based on magnetic nanobeads, these were used as solid support for HPV pseudovirions and after carrying out all the incubation steps of the ELISA test in microfluidic chip the final product of the reaction of substrate with HRP was detected on TLM. With magnetic nanobeads based ELISA assay with µFIA-TLM for measurement of antibodies against PsVs of HPV-16 virus an LOD of 0.6 ng/mL was achieved, which is six times lower in comparison to classic ELISA on microtiter plate. Furthermore, the analysis time was reduced from ten hours to 30 minutes. The novel method was successfully validated by analysis of real sera samples from women who were previously diagnosed for infection with HPV-16 virus. For determination of iodinated MRI contrast agents we developed a new method based on the measurement of concentration of released iodide which allows indirectly semi-quantitative detection of concentration of iodinated contrast agents. For iodide release from parent molecule of contrast agent we applied a chemical reaction with Cu2+ ions in the presence of H2O2. Released iodide was first oxidized into iodine and then extracted into chloroform. Contrast agents degradation reaction showed 70 % of efficiency for removal of iomeprol, taking into account the 60 % overall efficiency of iodide oxidation and extraction. The extract was injected into microfluidic chip and iodine concentration was determined with TLM. Chloroform as organic solvent with low thermal conductivity and high temperature coefficient of refractive index is a good choice for TLM measurement due to high TLS enhancement factor, which theoretically provides 40 times higher sensitivity of TLM measurements as compared to water and a four time improvement in sensitivity for each milliwatts of excitation power, when compared to spectrophotometry. The developed µFIA-TLM method for indirect determination of contrast agents based on detection of iodine provides around 60 times lower LOD, with low reagent and sample consumption in comparison to spectrophotometry. The LOD of 18 ng/mL for iomeprol achieved with TLM is 16 times lower in comparison to LOD of 294 ng/mL for iomeprol determination with HPLC. In comparison to LOD of 133 ng/mL for iomeprol achieved with detection of released iodide by ion chromatography, µFIA-TLM enables around 7 times lower LOD. HPLC and HPLC/MS analysis showed that the parent compounds is completely removed after 120 min. of chemical degradation and that different degradation products are formed by cleavage of one or two iodine atoms. By this we have shown that the applied chemical degradation is efficient for removal of iomeprol and could be applied for treatment of waste waters after further optimization and reduction of reaction time. New analytical methods developed within this work provide limits of detection for the selected compounds which are significantly lower (up to 60 times) in comparison to conventional analytical techniques based on transmission mode measurements. At the same time the new methods allows shorter time of analysis and higher sample throughput for the purpose of fast screening methods. Magnetic nanobeads based µFIA-TLM ELISA assays developed within this work offer several advantages in comparison to commercial ELISA tests on microtiter plates such as: higher surface for antibody binding, lower reagent consumption, and shorter analysis time. Although the TLS technique didn’t reach appropriate stage of development and applicability for routine chemical analysis, improved methods for detection of NGAL and antibodies against HPV viruses could be applied for clinical studies and development of commercial tests for detection of viruses or other bioactive substances, which are needed for diagnostic purposes in hospitals.
Keywords:ELISA, NGAL, PsVs, kontrastna sredstva, TLM
PID:20.500.12556/RUNG-2943 New window
COBISS.SI-ID:4654843 New window
Publication date in RUNG:02.02.2017
Copy citation
Average score:(0 votes)
Your score:Voting is allowed only for logged in users.
Share:Bookmark and Share

Hover the mouse pointer over a document title to show the abstract or click on the title to get all document metadata.

Secondary language

Title:Nove metode za detekcijo bioaktivnih spojin in njihovih učinkov na organizme in okolje
Abstract:Bioaktivne spojine so esencialne in neesencialne spojine, ki so del prehranske verige in vplivajo na delovanje organizmov, ali pa v njih povzročijo določene reakcije, vplivajo pa tudi na zdravje ljudi. Med različnimi bioaktivnimi spojinami, kot so tudi encimi in vitamini, so farmacevtske učinkovine ene najbolj poznanih. Najbolj široko uporabljena so različna protivnetna zdravila, antibiotiki, β-blokatori proti povišanemu krvnemu pritisku in statini proti holesterolu, od ostalih bioaktivnih snovi, povezanih z medicino, pa tudi kontrastna sredstva, ki jih uporabljamo za slikanje organov ter krvnih žil in pogosto povzročajo številne neželene učinke, kot je na primer pokontrastna nefropatija (angl. contrast induced nephropathy). Samo porabo antibiotikov ocenjujejo v svetovnem merilu na 200.000 ton letno. V preteklosti in tudi danes v postopku proizvodnje, ali še pogosteje po uporabi, farmacevtske učinkovine spuščamo v vodno okolje preko industrijskih izpustov, komunalnih odplak in bolnišničnih odpadnih vod. Nekatere farmacevtske učinkovine so zelo obstojne in jih zato v bioloških čistilnih napravah lahko samo delno odstranimo iz odpadne vode. Zato jih najdemo tudi v površinskih vodah in podtalnici ter posledično v pitni vodi. V okolju so prisotne v majhnih koncentracijah, vplivi dolgotrajne izpostavljenosti organizmov različnim farmacevtskim izdelkom ali njihovim mešanicam pa še niso dovolj raziskani. Komunalne in bolnišnične odpadne vode so tudi vir infektivnih organizmov, kot so npr. virusi, ki lahko prehajajo v vodno okolje tudi zaradi neprimernega ravnanja z infektivnimi odpadki. Biološke čistilne naprave iz vode odstranijo v povprečju le 50 % virusov, zato je voda kot »vir življenja«, lahko ključna za razširjanje nekaterih infektivnih organizmov, in z njimi povezanih bolezni, to pa zahteva stalen nadzor mikrobiološke kakovosti vode. Ker so koncentracije bioaktivnih snovi in infektivnih organizmov v telesu in okolju običajno zelo nizke, potrebujemo za njihovo določevanje visoko občutljive metode, predvsem kromatografske analizne tehnike sklopljene z masno spektrometrijo (GC/MS, LC/MS in LC–MS/MS) in transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM). Te metode so visoko občutljive, zahtevajo pa veliko časa in uporabo dragih aparatur in velikih količin reagentov in organskih topil, ki so škodljivi za okolje. Zaradi vse večje potrebe po analizah velikega števila okoljskih vzorcev, je nujen razvoj novih, tako imenovanih naprednih metod, ki omogočajo hitro in zanesljivo pregledovanje velikega števila vzorcev v čimkrajšem času. Analize s takimi "presejalnimi" metodami so praviloma manj natančne ali celo semikvantitativne, a kljub temu omogočajo zanesljivo identifikacijo neproblematičnih vzorcev in v praksi omejijo potrebo po uporabi zahtevnih klasičnih analiznih metod le na nekaj odstotkov vseh vzorcev. Zato je bil splošen cilj disertacije razvoj novih metod za občutljivo, hitro in cenovno učinkovito detekcijo farmacevtskih učinkovin, virusov in virusnih delcev v vodah in bioloških tekočinah in za ugotavljanje njihovih učinkov na organizme. Nove metode smo zasnovali na kombinaciji spektrometrije TLS (spektrometrija s toplotnimi lečami), mikrofluidike in imunoloških metod kot je ELISA. TLS kot visoko občutljiva tehnika (omogoča meritev absorbanc pod 10-6) lahko v kombinaciji z mikrofluidnimi tehnologijami zagotovi detekcijo zelo nizkih koncentracij analitov, krajši čas analize in manjšo porabo reagentov. V takih kombinacijah mikrofluidna tehnologija olajša in pospeši interakcije antigen-protitelesa ali encim-substrat v bioanaliznih sistemih, kar izhaja iz majhnih dimenzij kapilar in mikroreaktorjev (premer 10 do 100 µm), ki znatno skrajšajo difuzijski čas velikih biomolekul. Obenem pa mikrofluidni sistemi zaradi 100 do 1000-krat krajših optičnih poti v primerjavi s konvencionalnimi spektrometrijskimi tehnikami, zahtevajo zelo občutljivo detekcijo, ki jo v primeru nefluorescenčnih analitov lahko zagotavlja le TLS. Tako je bil npr. s kombinacijo mikrofluidne ELISA tehnike in mikroskopske TLS detekcije (TLM) za določevanje B-natriuretičnega peptida (ang. brain natriuretic peptide) skrajšan čas analize z 20 ur na 20 minut, kot je opisano v literaturi. Pomembno je tudi, da je odziv TLS signala hiter (milisekunde), kar je zaradi relativno visokih linearnih hitrosti pretokov v mikrofluidnih sistemih nujen pogoj za učinkovito detekcijo v submikroliterskih vzorcih s koncentracijami v območju pg/mL. Za dosego konkretnih ciljev doktorske disertacije smo razvili nove analizne metode za naslednje izbrane analite: - jodirana kontrastna sredstva, - NGAL- na nevtrofilno gelatinazo vezani lipokalin, kot novi biomarker pokontrastne nefropatije, oblike akutne poškodbe ledvic, - protitelesa proti humanim papiloma virusom (HPV) in HPV-16 pseudovirionom. Pri razvoju metod za detekcijo jodiranih kontrastnih sredstev smo raziskali tudi kemijsko razgradnjo jodiranih kontrastnih sredstev ter tako istočasno razvili metodo za njihovo morebitno odstranjevanje iz odpadnih vod. Pri uvodnih raziskavah za razvoj metode za določevanje NGAL kot osnovo uporabili komercialno dostopne ELISA teste. Končni produkt reakcije substrata s hrenovo peroksidazo (HRP) v ELISA testu smo injicirali v mikrofluidni sistem, ki je služil le za transport vzorca do TLM detektorja na mikročipu. Tako smo ob primerljivi hitrosti analize dosegli mejo detekcije 1.4 pg/mL kar je 7 krat nižje v primerjavi s komercialnim ELISA testom (10 pg/mL). V nadaljevanju smo za razvoj metode za določevanje NGAL z µFIA-TLM namesto komercialno dostopnih mikrotitrskih ploščic uporabili magnetne nanodelce kot trdne nosilce za primarna protitelesa ELISA testa. Protitelesa smo tako lahko z magnetnim poljem zadrževali v mikrofluidnem sistemu in v njem izvedli vezavo NGAL in sekundarnih protiteles, kot tudi reakcijo substrata s HRP. Metoda za določevanje NGAL je glede na meje detekcije (LOD je 2.3 pg/mL) občutljivejša v primerjavi s komercialnimi ELISA testi v standardnih mikrotitrskih ploščicah (LOD je 10 pg/mL) in bistveno skrajša čas analize. TLM v kombinaciji z mikročipom namreč omogoča krajši čas posameznega koraka inkubacije (z ene ure na le 5 min) v postopku pred samo detekcijo NGAL in s tem skrajša čas trajanja analize s štirih ur v primeru komercialnega ELISA testa na 35 minut ter tako omogoča analizo večjega števila vzorcev. Opravili smo tudi analizo realnih vzorcev krvi, ki je pokazala, da so vrednosti NGAL izmerjene z µFIA-TLM ob uporabi magnetnih nanodelcev primerljive z vrednostmi izmerjenim s komercialnim ELISA testom. Kratek čas analize ob nadaljnji optimizaciji odpirajo nove možnosti za uporabo testa v medicinski diagnostiki in kliničnih raziskavah. Razvita metoda za določevanje NGAL je ob uporabi ustreznih protiteles lahko primerna tudi za detekcijo drugih farmacevtskih učinkovin ali različnih onesnaževal v okolju. V okviru disertacije smo razvili tudi metodo za določevanje anti-HPV-16 L1 protiteles v serumu žensk, okuženih s HPV-16 virusom. Pri tem smo za zagotavljanje selektivnosti uporabili HPV/16 pseudovirione kot modelni sistem virusov za razvoj ELISA testa na mikrofluidnem čipu. Imobilizirani HPV-16 pseudovirioni služijo kot antigen na katerega se vežejo anti-HPV-16 L1 protitelesa, ki smo jih zaznavali s sekundarnimi, s HRP označenimi protitelesi in TLM detekcijo produkta encimske reakcije substrata in HRP. Ob izvedbi klasičnega ELISA testa na mikrotitrski plošči in merjenju na čitalcu mikrotitrskih plošč smo dosegli spodnjo mejo detekcije 3.8 ng/mL. Ob izvedbi meritve končne raztopine v mikrofluidnem čipu s TLM smo spodnjo mejo detekcije znižali na 0.9 ng/mL. Podobno kot pri metodi za določevanje NGAL smo v nadaljevanju raziskav uporabljali magnetne nanodelce kot trdne nosilce za pseudovirione in vse korake ELISA postopka izvedli v mikrofluidnem čipu kjer smo končni produkt reakcije substrata s HRP tudi detektirali s TLM. Tako smo za določevanje protiteles proti pseudovirionom HPV-16 virusom dosegli spodnjo mejo detekcije 0.6 ng/mL, kar je šestkrat nižje v primerjavi s klasičnim ELISA testom. Obenem smo trajanje analize skrajšali z 10 ur na 30 minut. Metodo smo uspešno validirali tudi z analizami realnih vzorcev serumov žensk pri katerih je bila predhodno potrjena okužba s HPV-16 virusom. Za detekcijo kontrastnih sredstev smo razvili metodo, ki preko meritve koncentracije sproščenega jodida omogoča posredno semikvantitativno določitev koncentracije jodiranih kontrastnih sredstev. Za sproščanje jodida iz matične molekule kontrastnega sredstva iomeprola smo uporabili kemično reakcijo z bakrovimi ioni Cu2+ v prisotnosti H2O2. Po predhodni oksidaciji sproščenega jodida smo jod ekstrahirali v kloroform. Reakcija razgradnje kontrastnih sredstev je pokazala približno 70 % učinkovitost za odstranjevanje joda z izhodne spojine, če upoštevamo 60 % skupni izmerjeni izkoristek oksidacije jodida in ekstrakcije joda s kloroformom. Kloroform kot organsko topilo je zelo primeren za TLM meritve zaradi visokega ojačitvenega faktorja, ki je povezan z nizko toplotno prevodnostjo in visokim temperaturnim koeficientom lomnega količnika kloroforma, in teoretično zagotavlja približno 40-krat višjo občutljivost kot pri TLM meritvah v vodi, ter za vsak milivat vzbujevalne moči štirikrat višjo občutljivost kot spektrofotometrija. Ekstrakt joda smo injicirali v mikrofluidni čip in določili koncentracijo joda z optotermično mikroskopsko tehniko TLM. Razvita metoda μFIA-TLM za posredno določevanje kontrastnih sredstev, ki temelji na detekciji joda, zagotavlja okrog 60-krat nižjo mejo detekcije v primerjavi s spektrofotometrijo. S kombiniranjem mikrofluidnih tehnologij in TLM smo uspeli izboljšati mejo detekcije ob manjši porabi reagenta in vzorca v primerjavi s spektrofotometrijo. Spodnja meja detekcije 18 ng/mL za iomeprol, ki smo jo dosegli z μFIA-TLM, je 16-krat nižja v primerjavi z LOD za detekcijo iomeprola s tehniko HPLC (294 ng/mL). V primerjavi z LOD za določevanje iomeprola preko detekcije jodida z ionsko kromatografijo (133 ng/mL), omogoča µFIA-TLM detekcijo okrog 7-krat nižjih koncentracij. S HPLC in HPLC/MS meritvami vzorcev raztopine po končanem postopku razgradnje kontrastnih sredstev pa smo pokazali, da izhodna spojina ni več prisotna in da nastajajo produkti, z različnim številom odcepljenih jodovih atomov iz izhodne molekule. S tem smo pokazali, da je uporabljena kemična reakcija razgradnje kontrastnih sredstev, kot je iomeprol, učinkovita in da bi jo lahko uporabili za odstranjevanje kontrastnih sredstev iz odpadnih vod. Reakcijo razgradnje kontrastnih sredstev, ki traja okrog 120 min lahko še skrajšamo z nadaljnjo optimizacijo reakcijskih pogojev. Nove analizne metode, razvite v tej disertaciji, zagotavljalo spodnje meje detekcije za izbrane spojine, ki so bistveno (tudi do 60-krat) nižje v primerjavi s klasičnimi analiznimi metodami s transmisijskim načinom merjenja. Istočasno nove metode omogočajo krajši čas analize in analizo večjega števila vzorcev za hitrejše izvajanje (fast screening) presejalnih testov. µFIA-TLM z uporabo magnetnih nanodelcev za določevanje NGAL in protiteles proti HPV virusom imajo v primerjavi s komercialnim ELISA testom na mikrotitrski ploščici številne prednosti, med katerimi so večja površina za vezavo protiteles, manjša poraba reagentov in tudi krajši čas analize. ELISA testi v mikročipih z uporabo mikrofluidnih črpalk omogočajo tudi lažje izvajanje korakov izpiranja in nanosa reagentov, ki so časovno zahtevni in pogosto prinašajo velike napake, če jih izvajamo z ročnim pipetiranjem. Čeprav tehnika TLS še ni dosegla primerne stopnje razvoja in uporabnosti za rutinske kemijske analize, lahko izboljšano metodo za detekcijo NGAL ali virusnih protiteles, ki smo jo razvili v okviru te disertacije, uporabimo za klinične študije in razvoj komercialnih testov za detekcijo virusov ali drugih bioaktivnih spojin za uporabo v bolnišnični diagnostiki.